Diagnozę zespołu Marfana, tak jak innych zaburzeń tkanki łącznej podejrzewać może lekarz klinicysta, jednak potwierdzić ją można jedynie analizą materiału genetycznego. W chwili obecnej jest wiele metod umożliwiających diagnostykę genetyczną. Najbardziej powszechnie stosowane, jest klasyczne sekwencjonowanie metodą Sangera, jednak obecnie coraz bardziej popularne są panele NGS oraz WES i WGS.
Dobór odpowiedniego badania genetycznego powinien być przedyskutowany zarówno przez lekarza kierującego, jak i przemyślany przez pacjenta. W przypadku wielu cech klinicznych mogących świadczyć o Zespole Marfana, można rozpocząć identyfikację, od analizy genu FBN1 metodą Sangera. Jeżeli wynik badania molekularnego jest odmienny od oczekiwań lekarza, może on zlecić sekwencjonowanie określonych paneli DNA metodami II generacji (NGS).
Chorób tkanki łącznej jest wiele, część objawów wspólna, a jednoznaczna ich klasyfikacja możliwa jest dzięki sekwencjonowaniu wielu znanych genów je warunkujących. Pomocne są także metody sekwencjonowania WES i WGS, dzięki którym możliwa jest wielkoskalowa analiza całych genów. WES i WGS to metody niezastąpione u pacjentów, u których występuje wiele, zróżnicowanych objawów, na podstawie których trudno jest wyznaczyć lekarzom konkretną ścieżkę diagnostyczną. Badania WES i WGS to najszybszy sposób na znalezienie przyczyny nietypowej choroby, co znacznie przyspiesza przejście przez tzw. odyseję diagnostyczną. Metody te stają się również stosunkowo coraz tańsze niż w porównaniu do tradycyjnych badań Sangerowskich.
| Nazwa badania genetycznego | Sekwencjonowanie Sangera | Sekwencjonowanie NGS | Sekwencjonowanie WES NGS | Sekwencjonowanie WGS NGS |
| Ilu genów dotyczy | Badanie konkretnego genu | Badanie do kilkuset genów | Badanie wszystkich genów, których jest około 22000 | Badanie wszystkich genów wraz z ich sekwencjami niekodującymi |
| Jakiej skali dotyczy badanie | Na podstawie przesłanek klinicznych, potwierdzenie danej mutacji | Wykrywanie mutacji w wybranych genach związanych z wieloma typami chorób | Wykrywanie mutacji w sekwencjach kodujących białka (eksonach) | Wykrywanie mutacji w sekwencjach kodujących białka i niekodujących |
| Metoda potwierdzenia | Wykrycie mutacji potwierdza się metodą Sangera | Wykrycie mutacji potwierdza się metodą Sangera | Wykrycie mutacji potwierdza się metodą Sangera |
Sekwencjonowanie I generacji – sekwencjonowanie metodą Sangera
W jakim celu się ją stosuje?
Metoda ta stanowi ?złoty standard? sekwencjonowania i jest to powszechnie wykorzystywana technika w rutynowej diagnostyce genetycznej. Sekwencjonowanie Sangera jest bardzo przydatne do weryfikacji rozpoznania klinicznego ustalonego na podstawie charakterystycznych dla danej choroby objawów. Metodę Sangera pozwala na sekwencjonowanie jedynie niewielkich fragmentów DNA. W metodach II generacji (NGS) wykryte warianty patogenne są potwierdzane metodą Sangera.
Jakie ma ograniczenia?
Cechuje się niską wydajnością. Metoda ta nadaje się raczej do analizy pojedynczych genów, niż wielu genów. Wynika to z faktu, że sekwencjonowanie Sangera jest zbyt kosztowne i pracochłonne, aby można ją było efektywnie zastosować do badania kilkudziesięciu czy nawet kilkuset genów.
Historia oraz metoda działania
Sekwencjonowanie Sangera zostało opracowane przez Fredericka Sangera i jego zespół w 1977 roku, za co otrzymał on w 1980 roku nagrodę Nobla. Było to ogromne osiągnięcie biologii lat 70 ? tych i 80 ?tych Metoda ta była wykorzystana do projektu mającego na celu sekwencjonowanie całego genomu ludzkiego (Human Genome Project) w latach 1990-2003. Obecnie sekwencjonowanie Sangera jest metodą wykorzystywaną do potwierdzania wariantów, które uzyskały niższe parametry jakości.
Metoda ta opiera się o zastosowaniu dideoksynukleotydów, które znane są również jako nukleotydy hamujące wydłużanie nici DNA, w skrócie pojawiające się jako ddNTP (ddGTP, ddATP, ddTTP i ddCTP). Ich działanie polega na zatrzymaniu reakcji wydłużania nowej nici DNA po ich przyłączeniu do łańcucha. Metoda ta zakłada dodanie do badanej próbki DNA pacjenta, która poddana jest łańcuchowej reakcji polimeracy (PCR), czterech deoksynukleozydów oraz dideoksynukleotydów.
Mieszanina reakcyjna zostaje podzielona na 4 odrębne probówki a do każdej z nich dodawany jest inny dNTP (dATP, dTTP, DTP, DTP). Poza dNTP do reakcji dodawane są również dideoksynukleotydy ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), które są wbudowywane w syntetyzowaną nić DNA. Dołączenie ddNTP uniemożliwia wydłużanie nici DNA. W ten sposób w powstaje mieszanina fragmentów DNA o różnej długości, zakończonych specyficznym nukleotydem.
Każdy dideoksynukleotyd ma unikalny ?znacznik?, (dawniej radioaktywny) który umożliwia jednoznaczną identyfikację A, T, C i G. Obecnie jako znaczniki, są często wykorzystywane koniugaty fluorescencyjne, co pozwala na wyznakowanie każdego dideoksynukleotydu innym fluorochromem, dzięki czemu, do odczytania pełnej sekwencji badanego DNA wystarczy jedna reakcja z zastosowaniem wszystkich ddNT.
Mieszanina produktów musi zostać rozdzielona według ich wielkości/długości metodą elektroforetyczną na żelu poliakrylamidowym ze stałym stężeniem środka denaturującego. Dzięki temu można analizować powstałe prążki dające sygnał fluorescencyjny. Pozwala to na zapisanie sekwencji w pamięci komputera, eliminując błędy wynikające z odczytywania sekwencji przez człowieka i wpisywania do pamięci komputera.
Sekwencjonowanie II generacji
Sekwencjonowanie nowej generacji NGS (ang. Next Generation Sequencing) to grupa metod pozwalających na wielkoskalowe ustalanie sekwencji genomu, , transkryptomu (RNA-Seq) a także epigenomu badanie interakcji białka z DNA (ChIP-sequencing). Metody te umożliwiają jednoczesne sekwencjonowanie nawet miliona fragmentów DNA. Opracowanie metod wielkoskalowych pozwoliło na znaczne obniżenie kosztów uzyskiwania sekwencji całych genomów.
Historia i metoda działania
Projekt sekwencjonowania ludzkiego genomu metodą Sangera zajął ponad dekadę. Obecnie jednak możliwe jest wykonanie sekwencjonowania ludzkiego genomu w zaledwie kilku dni. Czas i koszty sekwencjonowania znacznie spadły dzięki grupie technologii sekwencjonowania zwanej sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS). Metody NGS są znacznie szybsze niż sekwencjonowanie metodą Sangera, ponieważ opierają się na sekwencjonowaniu milionów małych fragmentów DNA z wielu różnych części genomu jednocześnie, zamiast ?czytać? w jednym fragmencie DNA z jednego regionu genomu. Ponieważ wszystkie te reakcje zachodzą ?równolegle w czasie? (w tym samym czasie), NGS jest czasem określane jako masowo równoległe sekwencjonowanie. Platformy do sekwencjonowania są oparte o macierze i pozwalają na sekwencjonowanie znacznie większej liczby odczytów w porównaniu do metod konwencjonalnych.
Dodatkową zaletą NGS jest to, że czułość wykrywania zmian (mutacji), występujących na bardzo niskim poziomie, jest znacznie bardziej efektywne niż w przypadku sekwencjonowania Sangerowskiego. W przypadku NGS zaledwie 2% -5% badanego DNA musi zawierać ten sam wariant lub mutację (wariant powodujący chorobę), które mają zostać wykryte.
W naszym materiale genetycznym DNA istnieją obszary, które kodują białka, jak również istnieją obszary zarówno w obrębie genów, jak i między różnymi genami, które białek nie kodują. Sekcje genów kodujące białka nazywane są eksonami, a obszary nie kodujące białek, które oddzielają eksony w obrębie jednego genu, nazywane są intronami. Obszary między różnymi genami są nazywane ?regionami niekodującymi?.
Wady metod sekwencjonowania NGS
Dokładność tej metody analizy wiąże się z czasem jej wykonania i interpretacji wyników. Stanowi to największą wadę metod NGS. Ponadto jest to dość droga metoda badania. Dlatego też mimo ogromu zalet, nie wszyscy się na nią decydują. Kolejną ważną decyzją, w wybraniu metod NSG (do których zalicza się WES i WGS) jest konsultacja z lekarzem specjalistą, czy w ogóle analiza każdego chromosomu jest konieczna.
Sekwencjonowanie całego egzomu WES i sekwencjonowanie całego genomu WGS.
Zbiór wszystkich eksonów wszystkich 20 000 znanych ludzkich genów jest nazywany egzomem, a sekwencjonowanie tego zestawu informacji przez NGS nazywa się sekwencjonowaniem całego egzomu WES (ang. Whole exome sequencing). Natomiast jeśli analizujemy całe DNA, w tym eksony, introny i regiony niekodujące, ten zestaw informacji jest nazywany genomem. Kiedy NGS jest używany do oceny całego ludzkiego genomu, nazywa się to sekwencjonowaniem całego genomu WGS (ang. Whole genome sequencing).
Czy metody oparte na NGS (panele NGS, WES, WGS) są droższe od tradycyjnych metod Sangerowskich?
NGS w wielu przypadkach stały się metodami tańszymi niż metody oparte na tradycyjnych technikach sekwencjonowania (Sangerowskiech). Dzieje się tak, ponieważ są to metody wysokoprzepustowe, co oznacza że pozwalają na równoległą analizę bardzo dużej liczby próbek.
W jakim celu stosuje się sekwencjonowanie DNA?
Istnieje wiele wskazań do sekwencjonowania DNA. Techniki te
można wykorzystać do sprawdzenia mutacji w obrębie jedynie jednego genu lub
kilku genów, co ma na celu zdiagnozowania chorób. Niżej podanych jest kilka przykładów:
- Sekwencjonowanie ukierunkowane metodą Sangera
Sekwencjonowanie wybranych wariantów lub obszarów w eksonach genu lub pełnych eksonach (segmenty DNA kodujące białka). Gdy znany jest wpływ niektórych rodzajów zmian na jeden lub więcej genów. Przykładem tego jest sekwencjonowanie genu FBN1. Mutacje (warianty powodujące choroby) w tym genie powodują zespół Marfana. - Sekwencjonowanie pojedynczego genu – sekwencjonowanie NGS wszystkich eksonów genu, często włączając części obszarów niekodujących (np. Sekwencja przed genem [promotor] lub między eksonami [introny]). Przykładem tego jest sekwencjonowanie genu FBN1. Mutacje (warianty powodujące choroby) w tym genie powodują zespół Marfana, zaburzenie, które wpływa na tkankę łączną, która składa się z wielu części ciała, w tym kości, mięśni, więzadeł, naczyń krwionośnych i zastawek serca. W FBN1 znaleziono ponad 1000 różnych mutacji, dlatego ważna jest ocena całej sekwencji genu FBN1. Tego typu badania są wykonywane przez znaczną większość placówek genetycznych.
- Sekwencjonowanie kilku genów metodą NGS – Sekwencjonowanie części lub wszystkich kilku genów w celu wykrycia mutacji (wariantów chorobotwórczych), które mogą powodować zaburzenia genetyczne. Przykładem tego jest panel do testowania mutacji w genach TGFBR1, TGFBR2, SMAD3, TGFB2 oraz TGFB3 które odpowiedzialne są za różne typu zespołu Loeys?Dietz, który ma wiele cech podobnych do zespołu Marfana.
- Sekwencjonowanie wielu genów metodą NGS ? wymienić tu można tak zwane panele na identyfikację chorób w obrębie genów warunkujących różne typy zbliżonych chorób np. zespołu Ehlersa-Danlosa, jednej z zespołów tkanki łącznej. Analiza sekwencji kodującej genów ADAMTS2, B3GALT6, B4GALT7, C1R, C1S, CHST14, COL12A1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL5A1, COL5A2, DSE, FKBP14, PLOD1, PRDM5, SLC39A13 i ZNF469, których mutacje mogą być odpowiedzialne za różne typy zespołów Ehlersa-Danlosa. Takie badania wykonuje Genomed.Wśród tego typu panelów znajdują się również panele mające na celu identyfikację wszystkich znanych wariantów obecnych w wielu genach (ponad 55) odpowiedzialnych za różne typy zespołów: Ehlersa-Danlosa (EDS), Marfana (MFS) i Loeysa-Dietza (LDS). Takie badania wykonywane są między innymi przez Genesis oraz Diagnostykę.
- Sekwencjonowanie całego eksomu (WES, ang. Whole-exome sequencing) jest metodą sekwencjonowania następnej generacji (NGS). WES jest badaniem mającym na celu poznanie sekwencji części kodującej ludzkiego genomu, zwanej eksomem, który zajmuje ok. 3% ludzkiego genomu, który składa się z około . 22 000 genów, w których łącznie jest około 180 000 eksonów. Pozwala na znalezienie wszystkich wariantów oraz predyspozycje do chorób nowotworowych. Takie sekwencjonowanie wykonywane jest przez coraz większą liczbę placówek genetycznych, jak chociażby MedGen.
- Sekwencjonowanie całego genomu (WGS, ang. Whole Genome Sequencing) jest metodą sekwencjonowania następnej generacji (NGS). Analizie poddane są zarówno sekwencje kodujące jak i niekodujące, których nieprawidłowości również są czynnikiem warunkującym wiele chorób, jest to zdecydowanie najdokładniejsza forma analizy genomu. Choroby związane z mutacjami w obrębie sekwencji niekodujących (MiRNA i długie niekodujące RNA i inne) to na przykład: Choroba Alzheimera (AD, choroba Parkinsona (PD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS), rdzeniowy zanik mięśni (SMA), choroba Huntingtona (HD) i wiele innych. Sekwencjonowanie WGS wykonywana jest między innymi przez Centrum Badań DNA.
Jak interpretować wynik badań genetycznych?
Dzięki zdolności do odczytywania ogromnych fragmentów DNA wyniki sekwencjonowania DNA należy interpretować ostrożnie, ponieważ nie wszystkie zmiany w sekwencji DNA mają znany efekt. Poprawną interpretację wyników sekwencjonowania gwarantuje wizyta u lekarza specjalisty (genetyka) lub lekarza prowadzącego.
Zmiany typu ?Disease-causing? lub “Pathogenic” lub ?Likely pathogenic?
Wiadomo, że niektóre zmiany (określane jako warianty, mutacje) powodują zmiany struktury (konformacji, budowy) białka, które może mieć wpływ na funkcję produktu genu (np. białka) i są one określane jako warianty powodujące chorobę lub ?patogenne?.
Wariant patogenny: zmiana w sekwencji genu ma bezpośredni związek z powstawaniem choroby. Równocześnie, istotne jest, że niektóre zmiany patogenne mogą nie mieć pełnej penetracji, co oznacza, że pojedyncza zmiana może być niewystarczająca do wywołania choroby pełnoobjawowej
Wariant potencjalnie patogenny: znaleziona zmiana w sekwencji genu jest z dużym prawdopodobieństwem (w wynikach genetycznych, istotne jest podkreślenie, że występowanie danego wariantu nie zawsze wiąże się z wystąpieniem choroby, istotne tutaj jest prawdopodobieństwo wystąpienia choroby) związana z powstawaniem choroby. Potencjalna patogenność wiąże się z tym, że w oparciu o aktualnie dostępne dane naukowe, nie jest możliwe stwierdzenie w 100% patogenności. Potwierdzenie patogenności wariantu wymaga dodatkowych badań i dowodów; jednak nie można też wykluczyć, że znaleziona zmiana ma niewielkie lub żadne znaczenie kliniczne.
Zmiany typu ?Benign? lub ?Likely benign?
Część zmian (warianty, mutacje) w obrębie genomu, nie ma negatywnego wpływu na końcowy produkt genu i takie zmiany są uważane za ?łagodne? (nieszkodliwe).
Wariant łagodny. Znaleziony wariant w sekwencji badanego genu, nie ma związku z powstawaniem choroby
Wariant potencjalnie łagodny. Zmiana w sekwencji badanego genu najprawdopodobniej nie ma istotnego związku z powstawaniem choroby, jednakże w oparciu o aktualnie dostępne literaturowe, nie ma też jasnej możliwości potwierdzenia łagodności danego wariantu. Potwierdzenie klinicznego znaczenia wariantu wymaga dodatkowych badań i dowodów. Nie można wykluczyć, że dalsze badania wykażą, że znaleziona zmiana ma znaczenie kliniczne i prowadzi do rozwinięcia choroby, jednak wariant ten jest potencjalnie łagodny.
Zmiany typu ?Variants of uncertain significance (VUS)?
Wariant o nieznanej patogenności. Nie ma jednoznacznych dowodów w danych naukowych, że niektóre zmiany są patogenne lub łagodne. Takie warianty są nazywane ?wariantami o niepewnym znaczeniu?. Nie jest na ten moment znane jaki jest charakter tych wariantów. Bazy danych, są aktualizowane, więc bardzo możliwe, że w przyszłości zostaną one skatalogowane do jednego z wyżej wymienionych.
Sekwencjonowanie III generacji
Technologia SMS (ang. Single Molecule Sequencing)
Techniki umożliwiające bezpośredni odczyt sekwencji z pojedynczej cząsteczki DNA. Najnowsze osiągnięcia nanotechnologii umożliwiają bezpośredni odczyt sekwencji z pojedynczej cząsteczki DNA bez konieczności jej amplifikacji (zwielokrotnienia). Metody te są obecnie niedostępna w Polsce.
Photo by National Cancer Institute on Unsplash
